بررسی نقش سیستئین ها و الیگومریزاسیون در ساختار و عمل آرتمین

جنین های سیستی آرتمیا اورمیانا از مقاومترین موجودات یوکاریوتی نسبت به استرس های شدید محیطی می باشند. بخشی از این مقاومت ناشی از وجود مقادیر بالای پروتئین استرسی آرتمین می باشد. آرتمین یک پروتئین 27 کیلودالتونی مقاوم به حرارت و غنی از سیستئین است. فراوانی سیستئین ها و آرایش فضایی درون مولکولی آنها موید این نظر است که آرتمین سیست ها را در مقابل تخریب اکسیداتیو حفاظت می کند و عملکرد آن وابسته به وضعیت ردوکس سلول است. در این مطالعه پس از تخلیص آرتمین از سیست، خصوصیات ساختاری و عملکردی آن مورد مطالعه قرار گرفت. پایداری حرارتی بالای این پروتئین امکان تخلیص آن به روش رسوب دهی با آمونیوم سولفات، انکوباسیون در 70 درجه سانتیگراد به مدت 14 دقیقه و نهایتا کروماتوگرافی تعویض یونی را برای ما فراهم کرد. آنالیزsds-page در شرایط احیایی و غیراحیایی نشان می دهدآرتمین تخلیص شده عمدتا به صورت الیگومر همراه با مقدار اندکی منومر می باشد. تعداد گروه های تیول آزاد و پیوندهای دی سولفید آرتمین به روش اسپکتروسکوپی ellman محاسبه شد. نتایج بیانگر وجود 9 گروه تیول آزاد (7 گروه پوشیده و 2 گروه سطحی) و تنها یک سیستئین درگیر در پیوند دی سولفید، در هر منومر آرتمین بود. داده های این بخش با نتایج آنالیزهای تئوری بر روی مدل ساختار سه بعدی آرتمین مطابقت داشت. براساس این مطالعات حداقل تعداد گروه های –sh سطحی آرتمین سه عدد بود. همچنین ظهور یک بند اضافی kda50 در sds-page غیراحیایی بیانگر وجود پیوند دی سولفید بین مولکولی بود که احتمال می رود بین هر دو منومر مجاور در الیگومر آرتمین موجود باشد. میزان بازیابی فعالیت آنزیم hrp در حضور چپرون احیاء شده (توسط dte و gsh/gssg) بررسی شد. نتایج نشان داد که اعمال شرایط احیایی توانایی چپرونی آرتمین را کاهش می دهد. آرتمین درe. coli سویه bl21(de3) بعنوان پروتئین نوترکیب بیان و با روش کروماتوگرافی تمایلی با خلوص بالا تخلیص شد. پس از تائید بیان آرتمین توسط sds-pageو بلاتینگ، پروتئین نوترکیب تحت شرایط احیایی refold شده و کلیه سیستئین های موجود در آن توسط یدواستامید بلوک شدند. تاثیر پروتئین نوترکیب refold شده و بلوک شده بر روی بازیابی فعالیت آنزیمی کربنیک انهیدراز دناتوره بررسی شد. نتایج بیانگر کاهش فعالیت چپرونی پروتئین آلکیله شده بود. مطالعات فلورسانس ذاتی پروتئین تحت شرایط احیایی نشان دهنده تغییر در ساختار سوم آرتمین بود. پارامترهای ترمودینامیکی آرتمین احیاء شده در حضور دناتورانت از نتایج حاصل از فلورسانس استخراج شد و مشخص گردید که میزان پایداری پروتئین احیاء شده نسبت به شرایط native تفاوت اندکی نشان می دهد.